动物源性食品中磺胺二甲嘧啶 ELISA 试剂盒
1 范围
本标准规定了磺胺二甲嘧啶（SM2）试剂盒产品的构成、技术要求、试验方法、检验规则及标志、包装、运输、贮存。
本标准适用于采用动物源性食品中磺胺二甲嘧啶酶联法快速检出方法的磺胺二甲嘧啶ELISA试剂盒（以下简称产品)，适用于动物源性食品中磺胺二甲嘧啶ELISA试剂盒快速半定量检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 191 包装储运图示标志
农业部 1025 号公告-24-2008 动物源食品中磺胺二甲嘧啶残留检测 酶联免疫吸附法
JJF 1070 定量包装商品净含量计量检验规则
国家质检总局第75号令《定量包装商品计量监督管理办法》
3 产品构成及规格
3.1 产品构成
产品主要包括检测酶标板（铝箔袋密封包装）、标准品六瓶（0 ng/ml、0.5 ng/ml、1.5 ng/ml、4.5 ng/ml、13.5 ng/ml、54 ng/ml）、10×浓缩酶结合物、10×浓缩洗涤液、酶结合物稀释液、显色剂 A、显色剂 B、终止液、盖板膜、说明书。其他相关试剂和设备不提供。
3.2 规格
应符合表1规定。
表1 规格
组成部分 规格
检测酶标板 96 孔酶标板 1 块
标准品六瓶 1ml/瓶
10×浓缩酶结合物 1.2 ml
10×浓缩洗涤液 50 ml
酶结合物稀释液 20 ml
显色剂 A 7 ml
显色剂 B 7 ml
终止液 7 ml
盖板膜 2 张
说明书 1 份
3.3 外观
应符合表2要求。
表2 外观
项目 要求
检测酶标板 试剂瓶 盖板膜
外观 密封包装 无破损,密封无泄漏 无破损
4 技术要求
4.1 技术原理
本试剂盒是利用免疫学竞争法的原理，在酶标板微孔上预包被抗磺胺二甲嘧啶抗体。检测时，加入标准品或样品溶液及 SM2 酶结合物，他们竞争性地与 SM2 抗体结合，形成抗原抗体复合物；用 TMB底物显色；加入反应终止液后在 450nm 波长酶标仪下进行检测，样品中的 SM2 浓度与吸收光强度成反比。
4.2 灵敏度
本试剂盒灵敏度为0.5 ng/ml。
4.3 检出限
高检测限：肌肉、肝脏、肾脏等组织最低检出限为 2 ng/ml，尿液最低检出限为 5 ng/ml，饲料最低检出限为 5 ng/ml，蜂蜜最低检出限位 5 ng/ml；
低检测限：肌肉、肝脏、肾脏等组织最低检出限为 10 ng/ml，尿液最低检出限为 10 ng/ml。
准确度
尿液添加回收率 90-115%，肌肉添加回收率 75-100%，肝样添加回收率 90-115%，蜂蜜添加回收率 100-115%，饲料添加回收率 75-100%。
4.4 精密度
根据SN/T0001-1995中规定，批内变异系数在小于10%，批间变异系数小于10%。
4.5 净含量偏差
净含量偏差应符合《定量包装商品计量管理办法》要求。
5 试验方法
5.1 试验条件
试验温度：15℃～30℃。
5.2 外观检查
目测无破损。
5.3 检出限的检测
5.3.1 制样
临用前纯水把磺胺二甲嘧啶标准液稀释至100 ng/ml做添加用。添加磺胺二甲嘧啶的浓度为0 ng/g，5 ng/g，10 ng/g。
5.3.2 提取
5.3.2.1样本前处理需配置：
配液 1：配液 1：3%三氯乙酸
量取 3g 三氯乙酸加蒸馏水定容至 100mL
配液 2：1M 碳酸钠
称取 10.6g 碳酸钠加蒸馏水溶解定容至 100mL
配液 3：0.2MPBS
称取 1.65g 二水磷酸二氢钠，67.83g 十二水磷酸氢二钠和 8.766 g 氯化钠加蒸馏水溶解定容至 1000mL
配液 4：1M 氢氧化钠（用于蜂蜜样品）
称取 4g 氢氧化钠加蒸馏水定容至 100mL
配液 5：0.1M 磷酸氢二钾（用于蜂蜜样品）
称取 22.8g 三水磷酸氢二钾加蒸馏水溶解定容至 1L
配液 6：1M 盐酸（用于蜂蜜样品）
量取 8.6mL 浓盐酸加蒸馏水定容至 100mL
5.3.2.2 低检测限样本提取
A、尿液
取1mL尿液，加入1mL蒸馏水，充分混合，取20μL进行分析。
B、猪肉、猪肝、饲料等
（1）称取2±0.05g匀浆组织于15mL离心管中，加入6ml 3%三氯乙酸，振荡10min，4000r/min离心5min；
（2）取1mL上清至1.5mL离心管中，加入40μL 1M Na2CO3，调pH值至中性，取20μL进行分析。
5.3.2.3 高检测限样本提取
A、尿液
取2mL尿液，加入8mL乙酸乙酯，震荡萃取10min，3000转以上离心10min，取上层液4mL，于60℃水浴条件下氮气吹干，加2mL0.2M PBS（配液3）溶解残留，取20μL进行分析。
B、猪肉、猪肝、饲料等
（1）称取2±0.05g匀浆组织于15mL离心管中，加入8mL乙腈混合，振荡20min，4000r/min离心5min；
（2）取2mL上清至另一15mL离心管中，60℃水浴条件下氮气吹干；
（3）加入1mL正己烷，用涡旋仪涡动20S溶解干燥的残留物，再加入1mL0.2M PBS（配液3）涡旋1min，4000r/min离心5min，除去上层正己烷相；
（4）取20μL水相进行分析。
C、蜂蜜
（1）取0.8g蜂蜜，放入15mL离心管中，加入3.2mL水和0.32mL1M NaOH(配液4)，混匀，加入4mL乙酸乙酯，剧烈振荡，室温4000r/min离心5min；
（2）弃去上层3mL，再加4mL 0.1M K2HPO4 (配液5) ，0.4 mL 1M HCl（配液6），混匀，加入3mL乙酸乙酯，剧烈振荡5min，室温4000r/min离心5min；
（3）移取2mL上层乙酸乙酯（相当于0.4g样品）到另一离心管中，60℃水浴条件下氮气吹干；
（4）用正己烷0.8mL溶解干燥的残留物，加入0.2MPBS（配液3）0.8mL，振荡2min，室温4000r/min离心5min，除去上层正己烷相；
（5）取20μL水相进行分析。
5.3.3 ELISA 检测
5.3.3.1 测定前须知：
（1）使用之前，将所用试剂和需用微孔板回升至室温。
（2）使用之后，立即将所有试剂放回 2~8℃。
（3）在使用中，不要让微孔干燥。
（4）ELISA 分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是 ELISA 测定程序中的关键。
（5）在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。
5.3.3.2 测定步骤：
（1）将所需试剂从冷藏环境中取出，在室温下平衡 30min 以上，每种液体使用前均须摇匀，注意标准品均需做 2 个平行试验。
（2）配液：
配液 A：洗涤工作液
将 50mL10×浓缩洗涤液用蒸馏水稀释至 500mL 备用。（可按需配制）
配液 B：酶结合物工作液
将酶稀释液将 10×浓缩酶结合物稀释 10 倍（如取 0.1mL 10×浓缩酶结合物+0.9mL 酶稀释液（临用时按需配制）
（3）加标准品或样品液 20μL 到相应的微孔中，然后加 80μL 酶结合物工作液（即配液 B）到微孔中用盖板膜盖好，26℃下避光反应 30min；
（4）小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤工作液（即配液 A）300μL/孔，充分洗涤 4~5 次，每次间隔 10s，在吸水纸上拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的吸头戳破）；
（5）显色剂 A 和 B 以 1：1 充分混合后，加 100μL 到微孔中，并在 26℃下避光反应 15min；
（6）加 50μL 终止液到微孔中，用酶标仪于 450nm 处测定 OD 值。
5.3.4 结果计算
所测得的标准品和样品吸光度的平均值除以第一个标准品（0 标准品）的吸光度值，再乘以 100（0标准品的百分吸光度值等于 100%），得到百分吸光度值。如下式：
标准品（或样品）的吸光度值
吸光度值 %=--------------------------------------------------×100
0准品的吸光度值
以标准品浓度的常用对数（10 为底）为横坐标 X 轴，百分吸光度值为纵坐标 Y 轴，绘制标准曲线。
将样本的百分吸光度值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，以此值作为 10 的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含磺胺二甲嘧啶的量。
5.3.5 注意事项
（1）室温低于 20℃或试剂及样本没有回到室温（20~25℃），会导致所有标准的 OD 值偏低。
（2）在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象，所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
（3）每加一种试剂前需要将其摇匀。
（4）反应终止液为 2M 硫酸，避免接触皮肤，如不慎滴漏到皮肤上，请尽快用水冲洗。
（5）不要使用过了有效期的试剂盒，也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
（6）储存条件：保存试剂盒于 2~8℃，不要冷冻，将不用的微孔板用盖板膜盖好后放进自封袋中重新密封，标准物质和无色的显色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
（7）试剂变质的迹象：显色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之，0 标准品的吸光度（450nm）值小于 0.6（A450nm<0.6）时，表示试剂可能变质。
（8）在加入显色剂后，一般显色 15min 即可，若颜色较浅，可延长反应时间到 20min（或更长），但不得超过 30min；反之，则缩短反应时间。
（9）该试剂盒最佳反应温度为 26℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
5.4 检出率检查
按5.3.1的方法制备样本各2个，采用5.3.2和5.3.3操作步骤平行试验10孔，计算回收率，符合准确度要求即为合格。
5.5 精密度测定
按5.3.1的方法制备样本各2个，随机抽取同一批次的检测试剂盒6盒，每盒抽取2个板条，采用5.3.2和5.3.3操作步骤分别平行试验48孔，根据检测结果计算出批内变异系数；同时随机抽取3个批次的检测试剂盒各2盒，每盒抽取2个板条，采用5.3.2和5.3.3操作步骤分别平行试验48孔，根据检测结果计算出批间变异系数。
6 检验规则
6.1 组批
以同一批次原料、同一班次、同一生产线生产的产品为一批。
6.2 抽样
从每批中随机抽取3盒（1盒用于检验，1盒用于复检，1盒用于留样）。
6.3 检验分类
6.3.1 出厂检验
产品应由生产企业质量检验部门逐批检验，合格后方可出厂并附合格证。出厂检验项目为外观、检
出限。
6.3.2 型式检验
有下列情况之一时，应进行型式检验
a） 新产品投产时；
b） 停产十二个月以上恢复生产时；
c） 原料、工艺有较大变化时；
d） 正常生产中每十二个月进行一次；
e） 国家质量监督机构提出要求时。
型式检验项目为本标准技术要求中的全部项目。
6.4 判定规则
出厂检验：如有不合格项时，对不合格项目进行复检，复检后仍不合格，则判定该批产品不合格。
型式检验：如有不合格项时，对不合格项目进行复检，复检后仍不合格，则判定该批产品不合格。
7 标志、包装、运输、贮存
7.1 标志
7.1.1 产品外包装上标志应符合 GB/T 191，并标明下列内容：
a） 企业名称、产品名称；
b） 生产日期；
c） 产品批号；
d） 产品标准号；
e） 产品商标。
7.2 包装
内包装材料采用镀铝铝箔袋；外包装采用瓦楞纸盒包装。
7.3 运输
产品允许使用一般交通运输工具，运输时轻装轻卸，运输过程中防止剧烈冲击、并防潮防晒。
7.4 贮存
产品应贮存于2～8℃密封、干燥、避光存放。
7.5 保质期
产品在上述条件下自生产之日起算保质期为12个月