原儿茶醛报告

HPLC法测定胎羊血浆中原儿茶醛的浓度

    丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltior. rhiza Bge.)的干燥根及根茎。丹参具有祛瘀止痛，活 血通经，清心除烦的功效。在妇产科方面，丹参制剂 常被用于治疗妊娠高血压综合征、妊娠肝内胆汁淤积 症、胎儿窘迫等疾病¨ 。但对于丹参制剂是否会经 母体进入胎儿体内尚不明确。本研究通过测定胎羊血 浆中丹参的有效成分原儿茶醛 ，考察丹参是否能通 过母羊进入胎羊体内，对研究丹参制剂在妊娠期应用 是否安全具有重要的意义。
 1材料

 1.1仪器、药品和试剂HPI100高效液相色谱仪； 丹参粉针剂，哈尔滨中药二厂，批号：060904，实验时 用生理盐水溶解；原儿茶醛(批号：0810—200004)、卡 马西平对照品(批号：0412—9503)，中国药品生物物 制品检定所；水为超纯水，甲醇为色谱纯，其他试剂 均为分析纯。

 1.2动物健康绵羊(湖羊)8头，羊龄2～3岁，体重 40～50 kg，由苏州大学医学院实验动物中心提供，实 验动物生产许可证号：XCYK(苏)2002—2008。

 2方法与结果

 2.1孕羊的外科手术及标本采集健康绵羊8头， 于妊娠116～125 d行母羊及宫腔内胎羊外科手术。术前24 h母羊禁食、禁水。术前和术中用氯胺酮和 异氟烷联合麻醉。母羊仰卧位固定，于下腹近腹中线 分层进腹，探查子宫，了解胎方位，固定胎羊后肢后 切开子宫壁，拉出后肢，于胎羊腹股沟中点偏内侧处 分别分离股动脉、股静脉，远端结扎，近端插入动静 脉导管，固定后回纳胎羊于宫腔内。缝合子宫壁后并 固定导管，缝合母羊腹壁，各种插管引至母羊背侧部 固定。术中母羊颈静脉插管补液，预防感染。术后 24 h母羊可恢复正常饮食饮水。用灭菌肝素盐水疏通 导管，分别给母羊静注庆大霉素72 mg，青霉素1 g 和胎羊静注庆大霉素8 mg，青霉素33 mg，每日1 次。手术恢复4—5 d后，通过母羊股静脉分别给予 不同剂量丹参粉针，于给药不同时间点分别采集胎羊 动脉血，取血分离血浆，于一20℃保存备用。

 2.2色谱条件 色谱柱：Hypersil ODS柱(250× 4.6 mm，5 Ixm)；流动相由甲醇(A)和0.2 tool-L 的 醋酸铵溶液(硫酸调pH至2.8)(B)组成，进行梯度洗 脱，在0—4 rain，B体积分数为70％，4～12 rain，B 体积分数由70％线性改变至10％，再返回起始流动 相；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL·min ；柱 温：35℃ 。

 2.3供试品溶液的制备 取血浆样品250 IxL，加 1 mol·L 盐酸100 L，酸化，加内标溶液20 L，无水乙醚2 mL涡旋7昆和提取2 min，离心(4000 r· min )10min。分取有机层，40cc水浴上通氮气挥干。 临用前残渣用100 IzL流动相溶解，进样20 L。

 2.4标准曲线的制备

 2.4.1标准工作液精密称取原儿茶醛对照品适量， 加1％ 醋酸配成浓度为0.2 mg·mL 的贮备液 ， 4℃保存。临用前，取原儿茶醛贮备液适量，用1％ 醋酸溶液按倍数稀释法稀释至所需浓度。

 2.4.2内标溶液精密称取卡马西平适量，用甲醇定 量稀释配成25 Ixg·mL 的内标溶液。

 2.4.3标准曲线的制备精密吸取不同浓度的原儿茶醛标准工作液5O L，加入空白血浆200 IxL，从“加 1 mol·L 盐酸100 IxL”起，按“供试品溶液的制 备”方法处理。以原儿茶醛与内标的峰面积比对原儿 茶醛的浓度进行线性回归，即得标准曲线。

 2.5样品测定方法精密吸取供试品溶液20 L注入 高效液相色谱仪，记录原儿茶醛与内标的峰面积，以原儿茶醛与内标的峰面积比为定量指标，根据标准曲 线计算相应的血药浓度。

 2.6分析方法的评价

 2.6.1特异性在本实验条件下，原儿茶醛有良好的 分离度，羊血清中杂质峰不干扰样品峰和内标峰的测 定。原儿茶醛和内标的保留时间分别是4.8 rain和 12.6 min，结果见图1。

 2.6.2精密度取空白血浆200 L，加入不同浓度 的原儿茶醛标准工作液50 L，制成高、中、低3种 不同浓度样品，按“供试品溶液的制备”方法处理， “样品测定方法”测定，考察原儿茶醛的日内、日间 精密度，结果见表1。

 2.6.3线性关系 取空白血浆250 IxL数份，分别加 入不同浓度原儿茶醛标准品，配制成浓度为0.02～ 12.5 g·mL 的标准品系列溶液，按“标准曲线的 制备”方法处理。记录原儿茶醛峰面积和内标峰面 积， 以样品峰面积与内标峰面积之比(Y)对原儿茶醛浓度(x)作线性回归，得回归方程：Y=一0.0289+ 0.158X，r=0.999，说明在0.02～12.5 Ixg·mL 范 围内原儿茶醛与内标的峰面积比(A样品／A内标)与其血 浆浓度线性关系良好，其最低定量限为20 ng·mL一1 o

 2.6.4回收率按“精密度”方法，计算测得量，用 测得量与加入量计算回收率，结果见表2。

 2.7胎羊血浆药物浓度的测定及结果将备用的血浆 37。(=溶解后，按“样品测定方法”测定，母羊静注 200，400，800 mg丹参粉针剂后胎羊血浆中原儿茶醛的浓度结果见表3，相应的平均药一时曲线见图 2。结果表明，于0.083，0.5，1.5 h，3个剂量组均 测得胎羊血浆中含有原儿茶醛，且随着给药剂量的增 加，血药浓度呈上升的趋势，具有一定的相关性。原 儿茶醛在胎羊体内很快吸收，达峰时间0.083 h，而 后以较快速度消除。2 h后，未测到原儿茶醛。

 由于中药制剂成分复杂，被测成分含量较低， 而胎羊体内浓度更低，给研究带来一定难度。本文 以原儿茶醛为检测指标， 以卡马西平为内标，用 HPLC法测定胎羊血浆中的原儿茶醛浓度，方法简 便可行。丹参制剂在妊娠期的研究已有很多，但多 限于机理探讨和临床应用 。本研究通过测定胎 羊血浆中原儿茶醛的浓度，明确了丹参制剂中原儿 茶醛可以通过胎盘屏障进入胎羊体内的，而且给药 剂量与胎羊的血药浓度具有一定相关性，但是否对 胎儿造成影响，尚需对丹参制剂的安全性作进一步研究。