A、间接气相色谱法
国内普遍采用的是在碱性条件下，以三乙胺为酯化剂，和靛红酸酐进行酯化反应，利用气相色谱进行内标法定量。由于靛红酸酐受热容易分解，不能直接进行气相色谱分析，需对其先进行酯化。
一、仪器和试剂
1.仪器
SC-石型气相色谱仪(四川分析仪器厂)
CR-3A色谱处理机(日本)
1S0C一100 恒温电磁搅拌器(上海有机所开发公司)
10微升微量注射器
搅拌子(自制, 外为玻璃细管密封, 内含铁丝)
2. 试剂和样品
无水乙醇(分析纯)三乙胺( 分析纯)靛红酸醉标样, 纯度为99 % (瑞尔丰化工提供)
邻氨基苯甲酸乙醋, 纯度为99% (瑞尔丰化工提供)
内标物, 邻苯二甲酸二甲醋( 色谱纯)
二、色谱条件
1.色谱柱: 2 米x 3 毫米不锈钢柱, 内装2%OV-17chromsorb WAW一DMCS(60一80目) 担体(日本)
2. 温度及气体流速
柱温17 2℃；
汽化温度230 ℃；
检测温度230 ℃；
载气(NZ),30 毫升/分；
燃气(H2),35毫升/分；
空气: 30毫升/ 分。
3.灵敏度及衰减: 10 x l/2
4. 纸速: 2 毫米/分
三、衍生化反应条件
靛红酸醉: 内标: 无水乙醇: 三乙胺=70毫克: 70毫克: 3毫升: 0.3毫升
水浴温度: 6 0 ℃ 一7 0 ℃
磁力搅拌反应时间: 大于10分钟
在上述色谱条件和衍生化条件下, 样品、内标和杂质均得到很好分离, 峰形对称。
四、定量分析
1. 反应转化率测定
称取纯品邻氨基苯甲酸乙醋0.070克和内标物0.070 克于15毫升磨口瓶中, 加5毫升无水乙醇, 摇匀, 在前述色谱条件下进样分析。测得邻氨基苯甲酸乙醋的相对校正因子f 值。
称取靛红酸醉标样0.070克和内标物0.070 克于15 毫升具塞磨口瓶中, 加3 毫升无水乙醇，0.3毫升三乙胺, 放人搅拌子, 调节好水浴温度, 即在前述的衍生化条件下进行醋化反应。反应完成后再加人适量无水乙醇, 摇匀后, 进针分析。测得一个相当于靛红酸醉对内标的相对校正因子f'。
2.样品测定
称取0.075克样品和0.070 克内标于15毫升具塞磨口瓶中, 加3 毫升无水乙醇,0.3 毫升三乙胺及搅拌子, 在前述衍生化条件下进行酷化反应。反应完成后再加人适量无水乙醇稀释, 摇匀后, 在前述色谱条件下按如下顺序进样分析: 标准溶液(靛红酸醉标液或邻氨基苯甲酸乙醋标液)、样品溶液、标准溶液、样品溶液。
B、直接液谱法
1 仪器与试剂高效液相色谱仪： 美国戴安公司PDA100，具可变波长紫外检测器； 色谱工作站； 色谱柱： 250mm×4.6mm （i.d.） 不锈钢柱，Kromasil C18 （ 5μm） ； 过滤器： 滤膜孔径约0.45μm； 定量进样阀： 20μL； 甲醇（色谱纯）；去离子水； 冰乙酸（分析纯）； 靛红酸酐标样（质量分数≥98%）。
2 操作条件流动相： 甲醇+水+冰乙酸=40+60+0.5 （V/V） ； 流速： 1mL/min； 柱温： 20℃；进样量： 20μL； 检测波长： 220nm； 保留时间：靛红酸酐约9.2min。
3 测定步骤
3.1 标样溶液的配制称取靛红酸酐标样
0.05g （精确至0.000 2g），置于100mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，超声10min，冷却至室温后作为母液，用移液管移取10mL母液至50mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，用微孔滤膜过滤，滤液待测。
3.2 试样溶液的配制称取试样0.05g （精确至0.000 2g），置于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用流动相定容至刻度，超声10min，冷却至室温后用移液管移取10mL至50mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，用微孔滤膜过滤，滤液待测。
3.3 测定在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻2针相对响应值变化<1.5%后，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。
4 计算
将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中靛红酸酐峰面积分别进行平均。
5结果与讨论
5.1 流动相的选择因靛红酸酐易水解，故在流动相中加入冰乙酸，调节流动相的pH值=4.0，抑制其水解。因靛红酸酐的主要干扰杂质为原料邻苯二甲酰亚胺，故使用甲醇+水+冰乙酸=40+60+0.5 （V/V），有效分离干扰物。
5.2 检测波长的选择利用二极管阵列检测器对靛红酸酐进行扫描得出，靛红酸酐在220nm及260nm处（图3） 有最大吸收峰，考虑到分离好、且无杂质干扰，故选用220nm作为检测波长。
5.3 方法的精密度测定按上述处理方法，同样的仪器条件，称取同一样品，进行5次平行测定，计算标准偏差和变异系数，结果统计靛红酸酐的标准偏差为0.02，变异系数为0.12。
5.4 线性相关性的测定从2.3.1标样母液中分别用移液管移取5、7.5、10、12.5、15mL至5个50mL容量瓶中，配制5个不同浓度（以x表示） 的靛红酸酐溶液，在前述操作条件下进行检测，测定靛红酸酐的峰面积y （表3），以标准溶液浓度x为横坐标，以峰面积y为纵坐标，进行线性相关分析。靛红酸酐的线性方程为y = 2 585.8x-8.122 5，R2 =0.999 7，相关系数r=0.9998，线性相关图。