异硫氰酸胍检测
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异硫氰酸胍应用之提取DNA和RNA

摘要:本文介绍了异硫氰酸胍的一种用途,即异硫氰酸胍法同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸。该方法综合了经典的Trizol提取法和以Trizol作为裂解液的硅胶模柱式提取法两种方法,弥补了两种方法的缺陷。
关键词:异硫氰酸胍法,593-84-0,提取DNA和RNA,Trizol提取法,硅胶模柱式提取法
前言
异硫氰酸胍,CAS号:593-84-0,分子式:C2H6N4S,分子量:118.161,白色结晶粉末,熔点115-120℃,用于变性裂解细胞;提取RNA和DNA,无RNA酶和DNA酶活性,强蛋白变性剂,是苏州亚科化学的优势产品。文章介绍了专利型异硫氰酸胍法提取同时提取DNA病毒和RNA病毒核酸。
异硫氰酸胍法提取同时提取DNA病毒和RNA病毒核酸
随着分子生物学的快速发展,基因诊断成为检测动物疫病最准确而有效地手段,进行基因诊断的过程中,病毒核酸的提取是进行检测的前提条件,核酸提取的质量也影响检测的准确性。
当前,动物病毒核酸提取方法主要有经典Trizol提取法和以Trizol作为裂解液的硅胶模柱式提取法两种方法。经典Trizol提取法过程繁琐、周期长、提取效率低、技术要求高,以Trizol作为裂解液的硅胶模柱式提取法成本较高、提取RNA的质量不高、且只能提取RNA病毒。
一种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法,包括步骤:对待提取物使用异硫氰酸胍裂解液裂解;硅胶膜吸附RNA;洗液Ⅰ除去杂蛋白;洗液Ⅱ洗去杂质;DEPC水洗脱核 酸;上述异硫氰酸胍裂解液包括3-7M异硫氰酸胍、0.6%-1.0%TriTon-100、30-50mM Tris-Cl、5-15mM DTT、60-90μg/mL蛋白酶K、10-30mM EDTA,PH在4.3-4.6。
上述洗液Ⅰ包括5-6M盐酸胍,53-59%无水乙醇,K70-90μg/mL蛋白酶,PH在6.4-6.6;上述洗液Ⅱ包括70-80%乙醇。
进一步地,上述异硫氰酸胍裂解液包括5M异硫氰酸胍、0.8%TriTon-100、40mM Tris-Cl、10mM DTT、80μg/mL蛋白酶K、20mM EDTA,pH在4.5。进一步地,上述洗液Ⅰ包括5.5M盐酸胍,56%无水乙醇,80μg/mL蛋白酶K,PH在6.5。进一步地,上述洗液Ⅱ包括75%乙醇。
上述操作步骤包括:
(1)取一干净离心管,100μL样品加入200μL的异硫氰酸胍裂解液中,振荡混匀,放置5分钟。
(2)加入与异硫氰酸胍裂解液等体积的无水乙醇,即200μL,颠倒反复混匀15秒。
(3)将过滤柱套在2mL收集管上,全部混合液移到过滤柱上,12,000rpm离心1分钟。
(4)弃收集管内的液体,往过滤柱加入600μL的洗液1,12000rpm离心1分钟。
(5)弃收集管内的液体,往过滤柱加入600μL的洗液2,12000rpm离心1分钟,再重复一次。
(7)弃收集管内的液体,过滤柱套在收集管上,12000rpm离心1分钟;
(8)换新的1.5mL离心管套上过滤柱,加20μLDEPC到过滤柱膜上,室温放置1分钟,12,000rpm离心1分钟,收集滤液,保存。
结束语
该发明的有益效果:同时提取动物血清样本、双拭子样本中的RNA病毒和DNA病毒核酸,具有方法简便、快速、成本低的特点。该方法为建立动物RNA病毒和DNA病毒多重PCR方法奠定核酸提取基础。

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